麦谷蛋白（Glu）是一种天然植物蛋白，具有营养丰富、来源广泛、低致敏性、良好的生物学价值等优点。Glu由10%的高分子质量Glu和90%的低分子质量Glu组成。低分子质量Glu不仅与自身结合，而且还通过分子内和分子间二硫键与高分子质量Glu亚基（GS）结合形成Glu聚集体，此结构特性大幅度的降低了Glu的柔韧性。而且Glu富含脯氨酸和谷氨酰胺，带电氨基酸比较少，使其在中性条件下溶解度较低，大大限制了其在食品制造业中的应用。对蛋白修饰的研究大多集中于物理处理、化学处理和生物酶修饰等方面。pH值偏移处理是一种可以定向诱导蛋白质结构变化从而有效改善蛋白质功能特性的方法，这种改性方法对Glu的影响至今少有人研究。

  湖北工业大学生物工程与食品学院的荣玉娟, 侯雨薇，周彬*等研究利用不一样pH值偏移处理条件对Glu进行改性，借助动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱、紫外光谱、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等方法探究pH值偏移处理对Glu功能特性的影响。以期通过pH值偏移处理改善中性条件下Glu的溶解性及拓宽其在食品领域的应用范围。

  如图1A所示，经过不同pH值偏移处理后Glu的溶解度均有所增加。这是由于pH值偏移处理过程中Glu发生了脱酰胺，酰胺键断裂，使酰胺基团转变为羧基，因而蛋白质带负电荷增加且静电斥力变大，同时蛋白质结构中氢键及范德华作用力减弱，导致蛋白质结构展开，水合能力增加。其中碱偏移处理下溶解度显著提升，特别是Glu-13的溶解度接近90%。在图1B可以直接观察到蛋白质溶液的宏观差异，碱偏移处理条件下蛋白溶液较均匀，溶液底部沉淀较少，其中Glu-12和Glu-13底部无明显沉淀。Glu溶解性增加原因是蛋白质结构在碱处理条件下形成了熔融球状，这增强了蛋白质-水相互作用的能力，导致Glu的溶解性明显地增加；也可能是由于蛋白质构象变化和可溶性蛋白质聚集体的形成。因此碱偏移处理是提高Glu在中性条件下溶解度的有效途径。

  不同pH值偏移处理下Glu的平均粒径如图2A所示。根据结果得出，与未处理的Glu相比，不同pH值偏移处理后的Glu平均粒径均显著减小。这原因是pH值偏移处理使Glu中的谷氨酰胺发生脱酰胺转换为谷氨酸，增加了蛋白质侧链羧基含量，增加相同条件下Glu的带电量，增大分子间静电斥力，降低氢键相互作用，抑制蛋白质分子的聚集行为，从而致使Glu粒径减小 。此外，碱偏移处理效果优于酸偏移处理。一般来说粒径越小的蛋白质聚集体越容易溶解，较小的蛋白质聚集体有助于增加水溶性，因为蛋白质和水分子之间的相互作用面积更大。此外，在pH值偏移处理后Glu的PDI均减小，碱偏移处理下PDI更小，溶液分散性更好。根据结果得出在碱偏移处理条件下使Glu远离其等电点（pH 4.9），产生了强烈的静电斥力，从而使其分散性更加均匀。

  从图2B能够准确的看出，经过pH值偏移处理后的Glu都带负电荷，这可能是在pH值偏移处理的过程中Glu发生了脱酰胺。大量不带电荷的极性天门冬酰胺和谷氨酰胺的中性酰胺侧链转变成带负电荷的羧酸基，从而生成了天冬氨酸和谷氨酸。碱偏移处理下净负电荷非常明显升高，表明在某些特定的程度上改变了蛋白质的构象使其暴露了内部的极性基团，因此随着表面极性基团的电离，更多的电荷积聚在分子表面以获得更高的净负电荷。而酸偏移处理下净负电荷略微减小可能是由于蛋白质的重新聚集掩埋了暴露在蛋白质内部分子表面的极性基团。正常的情况下由于蛋白质颗粒之间有较强的静电斥力，因此高净电荷体系相对来说比较稳定。带相同电荷的蛋白质链更容易相互排斥、解离或展开。蛋白质的表面电荷受亲水性和疏水性极性残基之间平衡的影响。

  此外，利用TEM观察Glu粒子的形态变化。由图2C可知，未经处理的Glu聚集体尺寸较大且分散不均一，经pH 1～3偏移处理后，Glu的聚集程度没有显著改善，仍处于紧密聚集状态。然而，经碱偏移处理后，其聚集程度显著减弱，且图2D粒径分布也显示粒子尺寸分布较为均匀，这与粒径分析结果一致。

  如图3所示，经pH值偏移处理后的Glu表面疏水性均有不同程度的提高。碱偏移处理下Glu的表面疏水性明显高于酸偏移处理，其中pH 13偏移处理下Glu的表面疏水性增加最显著。这可能是由于蛋白质结构在碱处理早期部分展开，导致一种变性与未变性的熔融球态。在此状态下蛋白质的疏水肽段和氨基酸残基的疏水侧链基团暴露增加。许多研究表明在极端酸碱处理条件下，蛋白的三级结构会发生明显的变化，二硫键可能断裂，从而削弱了侧链之间的相互作用，增加了疏水性和分子灵活性。当蛋白质回到中性状态时，蛋白间的重折叠过程会重新排列蛋白质表面的疏水基团。蛋白质表面疏水性受蛋白质表面与极性介质接触的疏水性区域数量的影响。此外pH值偏移处理过程中Glu发生了脱酰胺，随着脱酰胺的进行能够有效展开蛋白质的高级结构，使本来包埋在蛋白质内部的疏水基团暴露且使蛋白质的两亲性增加，同时增加了蛋白质在水中的溶解性。因此Glu表面疏水性的变化也反映了pH值偏移处理下其溶解性的变化。

  如图4A所示，对照组最大发射荧光波长为352 nm，而经过pH值偏移处理Glu样品的最大发射荧光波长均出现蓝移且荧光强度均发生不同程度的增加，碱偏移处理样品的荧光强度增幅更大，根据结果得出，pH值偏移处理诱导Glu构象发生解折叠，更多的荧光基团暴露出来。Glu的色氨酸微环境向更疏水的微环境偏移，更多疏水基团的暴露致使蛋白质环境更加疏水，这与疏水性结果一致。蛋白质中氨基酸微环境的变化也会改变紫外吸收波长，因此能用紫外光谱表征蛋白质结构的变化。如图4B所示，对照组最大峰值为276 nm，较对照相比pH值偏移处理后Glu的最大峰值均发生偏移。酸偏移处理下最大峰值偏移更显著（8 nm）。这些最大吸收峰的差异与苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的残留有关，最大吸收峰的红移表明了Glu氨基酸环境的变化。此外，从图中也能够准确的看出酸偏移处理后的特征吸收峰显著地增强，碱偏移处理后的特征吸收峰降低，说明pH值偏移处理会致使Glu构象发生转变。

  由图5A可知，经pH值偏移处理后Glu中巯基含量增加且总游离巯基含量均高于暴露游离巯基含量，说明蛋白质内部结构中仍存在大量巯基。经过pH值偏移处理后总游离巯基和暴露游离巯基含量均有所增多，较高的游离巯基含量表明由于蛋白质去折叠从而暴露了内部巯基，或是天然蛋白质中S—S键的断裂而产生新的巯基所致。从图5B中二硫键含量上也能够准确的看出，pH值偏移处理后样品的二硫键含量均减少，这说明在pH值偏移处理条件下蛋白质的二硫键发生不同程度的断裂，进而生成新的游离巯基，这也是导致总游离巯基增加的原因之一。同时暴露游离巯基含量的增加可能是由于pH值偏移处理后，Glu颗粒的大小和形态发生了变化，使得隐藏在Glu中的巯基暴露于蛋白质表面。

  采用SDS-PAGE分析pH值偏移处理后Glu分子质量及其主要亚基的变化。Glu由分子间二硫键相连的GS组成，GS中也存在分子内二硫键。通常GS由高分子质量GS和低分子质量GS组成。其中分子质量在20～70 kDa的是低分子质量GS，占Glu的90%，分子质量为80～130 kDa的是高分子质量GS，占Glu的10%。从图6可以观察到，Glu的主要条带集中在20～70 kDa处，在35 kDa处条带最深，表明分子质量大部分集中在此处。经过碱偏移处理后样品在20～25 kDa处产生了新的条带，表明碱偏移处理使Glu分解成了更小分子质量的肽段，这些低分子质量多肽可能是通过β-巯基乙醇分解S—S键而产生。

  从图7可知，Glu在1 637、1 525 cm－1 附近有2 个明显的吸收峰，分别为酰胺I带的C＝O和酰胺II带的N—H振动引起的。另外在3 300 cm－1附近有较宽的吸收峰，这归因于羟基的伸缩振动。其中，酰胺I带对蛋白二级结构的影响最具价值，因此对酰胺I带进行研究且通过拟合后发现酰胺I带可获得4 个条带，分别是β-折叠、无规卷曲、α-螺旋和β-转角。从表1能够准确的看出，通过pH值偏移处理后Glu的α-螺旋含量下降，有研究表明表面疏水性与α-螺旋含量呈负相关，表面疏水性会随着α-螺旋含量的降低而增加，这与疏水性结果一致。另外pH值偏移处理过程中Glu发生了脱酰胺，使谷氨酰胺转变为谷氨酸，以此来降低了含有氢键的β-折叠结构，使其转变为更具柔性的无规卷曲和β-转角结构。

  本研究考察了pH值偏移处理对Glu结构及理化性质的影响。根据结果得出，碱偏移处理可明显降低Glu分子的聚集程度，有利于Glu的溶解。经pH值偏移处理的Glu表面疏水性均有不同程度的增加，且碱偏移处理下表面疏水性要高于酸偏移处理。此外，pH值偏移处理会导致Glu分子中二硫键不同程度的断裂，且碱偏移处理下更多二硫键断裂生成巯基，使Glu分子中游离巯基含量增加。二级结构分析根据结果得出，经pH值偏移处理后α-螺旋和β-折叠含量下降，而β-转角和无规卷曲结构含量有所增加。本研究对改善Glu功能特性，拓宽其在食品制造业的应用场景范围具有积极的意义。

  本文《pH值偏移对麦谷蛋白结构的修饰及溶解性的提升》来源于《食品科学》2023年44卷第20期20-27页，作者：荣玉娟, 侯雨薇, 曹晓倩, 张佳佳，周 彬*。DOI:10.7506/spkx0209-088。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

  责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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