作为一种重要的谷物，小麦具有较高的营养价值，富含B族维生素、蛋白质和矿物质，大范围的应用于面条、面包、饼干等加工食品中。然而，小麦可以诱发乳糜泻、面包师哮喘症、特异性皮炎和小麦依赖运动激发过敏症等过敏反应。小麦致敏原根据其溶解性可大致分为可溶性蛋白（可溶于水和盐）、醇溶蛋白（溶于70%乙醇）和麦谷蛋白（溶于弱酸或弱碱）。其中，低分子量谷蛋白（LMW-GS）与许多小麦过敏的临床症状有关。
LMW-GS由3个分子量为30～80 kDa的亚基组成，约占小麦蛋白质的40%。因其溶解性差、分子量与醇溶蛋白相近，LMW-GS的提取和分离存在一定的难度。致敏原的致敏性主要根据其表位。表位多位于抗原表面，由相应抗体或致敏淋巴细胞识别。相似表位的存在可能会诱发免疫球蛋白E（IgE）的交叉反应。经典的表位鉴别判定的方法，如重叠肽和蛋白质芯片等，存在昂贵、耗时的局限性。目前，中国小麦致敏原的表位尚未得到系统研究。
本文建立了一种简单的离子交换色谱高度纯化LMW-GS的方法，对样品进行双酶切处理后（胰蛋白酶和凝乳胰蛋白酶）通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行检验确定。此外，还表征了纯化后LMW-GS的二级结构和致敏性，并通过生物信息学方法预测了中国小麦（小偃6号）中LMW-GS的IgE表位，结合竞争性酶联免疫吸附反应法（icELISA）进行进一步鉴定。
LMW-GS主要由三个区域（B：40～50 kDa，C：30～40 kDa和D：55～70 kDa）的亚基组成。通过SP-Sepharose离子交换色谱对麦谷蛋白进行纯化。结果如图1所示，可以观察到两个洗脱峰。其中，洗脱峰1的馏分不仅含有目标蛋白，还含有几种分子量低于30 kDa的非特异性蛋白。在洗脱峰2的SDS-PAGE电泳图中观察到7条分子量为30～70 kDa的电泳条带。进一步通过凝乳胰蛋白酶和胰蛋白酶双酶切处理后进行LC-MS/MS检测。纯化蛋白质的总离子流色谱图显示多个峰，共检测到545种肽。其中有16种肽与小偃6号的LMW-GS匹配，氨基酸序列具有83.3%的同源性。鉴定该纯化蛋白是分子量为30～70 kDa的LMW-GS。
图1 LMW-GS纯化过程的（A）色谱图、（B）总离子流色谱图和（C）氨基酸序列图
采用圆二色谱分析纯化后LMW-GS的二级结构。根据结果得出，LMW-GS含有16.8%的α-螺旋、8.8%的β-折叠、32.6%的β-转角和41.8%的无规则卷曲（图2A）。LMW-GS富含β-转角和无规则卷曲，这两种结构一般分布在蛋白质的外部，更容易形成IgE表位。LMW-GS在235 nm和280 nm处具有紫外吸收峰（图2B）。在280 nm处的弱特征峰归因于LMW-GS中缺少芳香族氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）。在235 nm处的吸收峰原因是LMW-GS中二硫键的存在。
图2 LMW-GS的（A）圆二色谱、（B）紫外光谱、（C）IgE结合能力及（D）IgE免疫印迹条带图
利用10位小麦过敏患者的血清进一步分析LMW-GS的致敏性。结果如图2C所示，纯化LMW-GS的IgE结合能力随其浓度的增加而明显提高，表明其具有较强的免疫原性。同时，在纯化后LMW-GS的IgE免疫印迹条带图中（图2D），分子量为30～70 kDa的条带表现出较高的致敏性，这与SDS-PAGE的结果一致，表明LMW-GS的3种亚基均具有非常明显的致敏性。
采用DNASTAR 11.0 Protean模块、AnTheProt 5.0软件、IEDB、IMED以及ABCpred在线网站等免疫学工具，根据LMW-GS氨基酸序列预测其IgE表位。通过5种免疫学工具预测了36种肽为LMW-GS中的潜在致敏原表位，选择了其中8种作为候选IgE表位，并分别命名为T-01至T-08进行后续验证。
采用icELISA比较分析纯化的LMW-GS与合成的表位肽之间的IgE竞争作用，以验证候选肽与IgE的结合能力。结果如图3所示，在8个候选表位中，有5个表位（T-01、T-02、T-03、T-06和T-07）的抑制率与浓度的对数值呈线性相关，表明它们能与IgE结合，进而有效抑制纯化LMW-GS和IgE之间的反应。其中，T-06、T-03和T-07表现出较强的IgE结合能力。因此，这5种候选肽为中国小麦（小偃6号）LMW-GS的IgE多肽
图3 候选肽的icELISA标准曲线种不同品种的中国小麦以分析LMW-GS的同源性。如图4所示，这4种小麦序列同源性超过75%。同源性较高的区域大多分布在在氨基酸AA 20-40、AA 110-120、AA 200-280和AA 310-322。T-01、T-02和T-06三个表位肽分布在氨基酸序列的保守区，这可以解释不同品种小麦LMW-GS存在交叉反应的原因。此外，T-03和T-07表位肽位于氨基酸序列非保守区，可能是中国小麦LMW-GS的特异性表位。
近年来食物过敏成为全世界共同关注的焦点话题。小麦是中国主要致敏性食品。本文建立了一种简单有效的方法，可以排除醇溶蛋白的非特异性干扰以获得高纯度的LMW-GS，其富含β-转角和无规则卷曲结构，并具有较强的致敏性。此外，对LMW-GS的抗原表位肽进行检验确定，确定了5个关键抗原表位区域（T-01、T-02、T-03、T-06和T-07）为中国小麦（小偃6号）LMW-GS的IgE抗原表位。本文可为小麦过敏的预防以及低致敏性小麦产品的开发提供新思路。
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