牛乳过敏是最常见的食物过敏反应之一，发病后易引起腹痛、腹泻，甚至血便等一系列临床症状。β-乳球蛋白（BLG）是牛乳清蛋白的主要成分，约占60%，被认为是牛乳过敏原的特异性标志蛋白。目前，通过天然产物与BLG非共价相互作用降低其致敏性的方法受到较大关注。木犀草素（LUT）作为一种抑制剂，可以对食品工艺流程中晚期糖基化终末产物的形成进行相对有效调控，来提升食品加工安全性 。超声波技术作为一种安全高效的非热加工技术在降低食物中过敏蛋白的致敏性方面有显著效果。
江西师范大学生命科学学院 的王梯梯、邵艳红*、涂宗财*等人 以BLG为研究对象，探究超声波辅助LUT处理对其结构和致敏性变化的影响，采用荧光滴定实验分析LUT与超声波处理前后BLG的相互作用力，然后通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、圆二色光谱、内源性荧光光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱等技术探讨研究BLG的结构变化，最后通过酶联免疫吸附测试（ELISA）评估BLG的IgE结合能力、人嗜碱性粒细胞KU812中生物活性介质白细胞介素-6（IL-6）、IL-4和组胺（HIS）释放情况，最终阐述BLG结构变化对其致敏性的影响规律，为消减BLG致敏性扩制品的应用与发展提供理论基础。
样品进行以下5 种处理：BLG溶液经超声波处理，记为UBLG；BLG、LUT磁力搅拌混合5 min，记为BLG-LUT；BLG、LUT混合经超声波处理，记为U（BLG-LUT）；BLG经超声波预处理后加入LUT，记为UBLG-LUT；BLG经超声波预处理后加入LUT，再次进行超声波处理，命名为（UBLG-LUT）U；将未做任何处理的BLG蛋白溶液记为NBLG。
通过分析NBLG、UBLG、BLG-LUT、UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的FTIR光谱，确定BLG与LUT之间的结合方式。如图1所示，所有样品的FTIR光谱均在约1540 cm－1和1637 cm－1处有两个强峰，即酰胺I和酰胺II带的特征峰；与NBLG相比，BLG-LUT、UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的酰胺I带特征峰均出现轻微红移，此特征峰的变化常被认为与氢键和静电相互作用有关，这表明BLG与LUT之间有氢键和静电相互作用；UBLG、BLG-LUT、UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的FTIR光谱均未出现新的信号峰，说明BLG与LUT之间通过非共价键结合。
NBLG、UBLG、BLG-LUT、UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的二级结构特征如表1所示。NBLG的二级结构中α-螺旋占19.75%，β-折叠占30.02%，β-转角占19.60%，无规卷曲占30.61%。与NBLG相比，UBLG的β-折叠相对含量显著下降，β-转角相对含量明显地增加（P＜0.05），无规卷曲相对含量有所增加，但无显著差异（P＞0.05），这说明超声波处理改变了BLG的二级结构，促使β-折叠向β-转角和无规卷曲转变。这还在于超声波的空穴和机械作用使BLG发生去折叠，紧密的立体结构变得疏松，使LUT更易与BLG结合。与NBLG相比，BLG-LUT的α-螺旋相对含量减少了0.64%、β-折叠相对含量增加了2.68%、无规卷曲相对含量下降了1.78%，表明BLG与LUT发生非共价相互作用，使BLG向有序的二级结构转变。与BLG-LUT相比，UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的β-折叠相对含量分别进一步增加了7.15%、6.33%、7.61%，无规卷曲相对含量则相应下降了6.70%、6.19%、4.72%。这主要是由于超声波产生的空化力、湍流和强烈剪切力。
如图2A所示，在激发波长为280 nm时，NBLG内源荧光强度在336 nm附近有最大吸收值，与其相比UBLG的最大吸收值增加，表明超声处理后BLG内源荧光强度增加。与NBLG相比，BLG-LUT荧光强度下降，说明LUT与BLG之间的相互作用改变了BLG构象，猝灭其内源荧光；与BLG-LUT相比，UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的荧光强度进一步下降，下降程度为（UBLG-LUT）U＞U（BLG-LUT）＞UBLG-LUT＞BLG-LUT，表明超声波处理诱导了BLG结构展开，可能使LUT更易与BLG结合，两者间的相互作用猝灭了BLG的内源荧光，其中二次超声辅助LUT处理对BLG内源荧光的影响最显著。
如图2C所示，与NBLG相比，UBLG色氨酸残基的最大荧光强度增加，表明超声波处理引起BLG结构展开，暴露出更多色氨酸等残基，与内源荧光光谱分析结果一致（图2A）；其最大激发波长从277.8 nm蓝移至277.4 nm，说明超声波处理使色氨酸微环境的极性降低，使其暴露在更疏水的环境；与NBLG相比，Δλ＝60 nm时，BLG-LUT色氨酸残基的最大荧光强度下降，其最大激发波长红移了0.4 nm；说明BLG分子内色氨酸微环境的疏水性降低，LUT可能通过与色氨酸残基结合引起BLG的构象变化。与BLG-LUT相比，UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的最大激发波长分别红移0.8、0.8、1.6 nm，最大荧光猝灭程度为（UBLG-LUT）U＞U（BLG-LUT）＞UBLG-LUT＞BLG-LUT，说明超声波预处理促进LUT与BLG结合，二次超声辅助LUT处理对BLG分子内色氨酸残基微环境极性的影响最显著。此外，如图2B所示，Δλ＝15 nm时所有样品最大激发波长几乎不变。以上根据结果得出，BLG的荧光猝灭主要为色氨酸残基。
如图2D所示，NBLG的最大紫外吸收峰出现在278 nm附近，由于超声波的空穴效应和机械效应可能会使蛋白质结构伸展，分子内部色氨酸和酪氨酸等生色基团暴露于表面，导致UBLG的紫外吸收强度增加，这与同步荧光光谱分析结果（图2B、C）一致。与NBLG相比，BLG-LUT紫外吸收强度的增加可能是由于二者发生相互作用使BLG构象发生明显的变化，促使色氨酸和酪氨酸残基暴露。与BLG-LUT相比，UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U的最大紫外吸收峰值逐渐增加，说明超声波预处理促进BLG与LUT发生相互作用，二次超声逐渐增强了二者之间的相互作用，暴露了更多的生色基团，导致BLG的紫外吸收强度最大。
如表2和图3所示，BLG具有两个荧光峰，其中峰a代表色氨酸和酪氨酸残基的荧光特征峰；峰b反映多肽主链结构的荧光信息，与蛋白质的二级结构有关；峰c为瑞利散射峰。NBLG峰a和峰b的最大荧光强度分别为2278和784.2，加入LUT后BLG-LUT峰a最大荧光强度降低，原因是产生了BLG-LUT稳态复合物，减少了NBLG中色氨酸和酪氨酸残基的荧光发射，这与内源荧光猝灭结果（图2A）相一致。与BLG-LUT相比，UBLG-LUT、U（BLG-LUT）、（UBLG-LUT）U复合物的峰面积和荧光强度逐渐减弱，表明超声波预处理促进LUT与BLG相互作用，导致更大程度的构象改变，其中（UBLG-LUT）U的峰a值和峰b值最大荧光强度分别降至最低1572和513.8，表明二次超声辅助LUT处理对BLG色氨酸荧光基团微环境的变化影响最大。
如图4C、D和表3所示，与NBLG相比，UBLG显示出更大的结合常数（145.34×10 4 L/mol）与结合位点数（1.275），表明超声波处理后的BLG更易与LUT发生相互作用。此外，NBLG/UBLG与LUT的结合常数 K a 均随反应温度的升高而增大，说明反应温度上升，NBLG和UBLG与LUT的相互作用均增强，复合物越稳定 。
根据Van’t Hoff方程计算NBLG、UBLG与LUT结合的热力学参数焓变（ΔH）、熵变（ΔS）和自由能变化（ΔG）。如表4所示，NBLG、UBLG与LUT结合的ΔH分别为46.01、25.88 kJ/mol，ΔS分别为0.256、0.200 kJ/(mol·K)，说明NBLG/UBLG均以疏水相互作用为主要作用力与LUT发生相互作用，超声并未改变BLG与LUT之间的主要作用力。UBLG与LUT结合的ΔH低于NBLG，说明UBLG与LUT发生相互作用所需的能量更低，因此更易发生相互作用。此外，所有条件下ΔG均为负值，ΔS均大于0，说明NBLG/UBLG与LUT发生的反应是一个熵驱动的自发吸热过程。以上根据结果得出超声波处理未改变BLG与LUT之间的相互作用力，超声波处理BLG与LUT更易发生反应。
如图5A所示，与NBLG相比，UBLG的IgE结合能力增加，表明超声波处理产生的高压力和剪切力影响了BLG结构，可能使其暴露更多IgE表位，导致IgE结合能力增加。与NBLG相比，BLG-LUT的IgE结合能力变弱，这是由于LUT与NBLG相互作用导致BLG的二、三级结构变化，表现为β-折叠相对含量增加，无规卷曲相对含量下降（表1），内源荧光和三维荧光强度下降（图2、表2），引起BLG上IgE过敏表位变化，导致其IgE结合能力变弱。与BLG-LUT相比，UBLG-LUT的IgE结合能力进一步下降，是因为BLG经超声波预处理，促进了其与LUT的相互作用，导致BLG的二、三级结构发生更大改变，IgE过敏表位受到破坏，致敏性逐步降低。与UBLG-LUT相比，U（BLG-LUT）的IgE结合能力增加，说明BLG-LUT经过超声处理后其内源荧光、三维荧光强度虽然再次降低，但对BLG过敏表位的破坏较小。所有样品中（UBLG-LUT）U的IgE结合能力最低，说明超声波处理后BLG更易与LUT相互作用，二次超声进一步增大BLG与LUT的接触程度，引起其构象表位发生显著变化。以上根据结果得出二次辅助LUT处理BLG的降敏效果最显著。
通过KU812细胞活化脱颗粒释放的生物活性介质(HIS、IL-6、IL-4)进一步评价NBLG、UBLG、BLG-LUT、UBLG-LUT、U(BLG-LUT)、(UBLG-LUT)U的致敏性。如图5B～D所示，与Control组相比，NBLG、UBLG、BLG-LUT、UBLG-LUT、U(BLG-LUT)和(UBLG-LUT)U的HIS、IL-6和IL-4质量浓度均明显地增加(P＜0.05)，说明BLG可诱导KU812细胞过敏相关细胞因子的释放。与NBLG相比，UBLG诱导KU812细胞脱颗粒率增加，表现在HIS、IL-6和IL-4质量浓度均明显地增加(P＜0.05)，这可能是由于超声处理使UBLG结构展开，暴露出更多的过敏表位，增强了其诱导的细胞过敏反应，这与IgE结合能力结果一致。与NBLG相比，BLG-LUT处理的KU812细胞脱颗粒率下降，这可能是由于LUT与BLG相互作用使其结构改变，过敏表位被破坏或掩藏。与BLG-LUT相比，UBLG-LUT、U(BLG-LUT)和(UBLG-LUT)U诱导的KU812细胞释放的HIS、IL-6、IL-4进一步下降；其中，(UBLG-LUT)U诱导的KU812细胞脱颗粒率下降最显著(P＜0.05)。这是因为超声预处理可以使BLG的结构展开，暴露更多的LUT结合位点，增强UBLG和LUT的结合强度，再次超声可能会更加促进二者的相互作用，导致(UBLG-LUT)U结构显著变化，其过敏表位受到掩藏或破坏以此来降低致敏性。
本实验探究了超声波辅助LUT对BLG结构及致敏性变化的影响规律，结果发现，二次超声波辅助LUT处理可明显降低BLG致敏性，表现为IgE结合能力及KU812细胞中HIS、IL-6和IL-4释放水平的降低。二次超声波辅助LUT处理BLG，改变其二级结构和三级结构，表现在内源荧光强度、三维荧光强度、紫外吸收强度和圆二色光谱的变化，这些结构变化可能会破坏BLG的IgE表位，以此来降低其致敏性。本研究结果将为生产低致敏性乳制品提供理论基础，但致敏性的评价并不全面，需要更加多的实验（如动物和临床试验等）验证其效果。
本文《超声波辅助木犀草素处理对β-乳球蛋白结构及致敏性的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第11期48-56页，作者：王梯梯, 王阳, 邹琳, 刘 俊，邵艳红，涂宗财。DOI:10.7506/spkx0722-261。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：美娟；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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